Pour la première fois, une équipe de l’Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC, Université de Strasbourg/CNRS/Inserm) a réussi à photographier en entier, en 3D et à haute résolution (1), une petite molécule vitale, enfermée au cœur de nos cellules : le récepteur de la vitamine D (VDR). Publiée le 18 janvier 2012 dans la revue The EMBO Journal, cette étude apporte des informations clefs sur la structure 3D et le mécanisme d’action du récepteur au niveau moléculaire. Ces données sont cruciales pour la recherche pharmaceutique, le VDR étant impliqué dans de nombreuses maladies, comme les cancers, le rachitisme et le diabète de type 1.

© IGBMC (CNRS / Inserm / Université de Strasbourg)

Appartenant à ce que les biologistes appellent “la grande famille des récepteurs nucléaires”, des protéines actives dans le noyau des cellules, dont font aussi partie les récepteurs « stéroïdiens » (récepteurs aux hormones sexuelles, etc.), le récepteur de la vitamine D (VDR pour vitamine D receptor) joue un rôle primordial. Il régule l’expression de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques vitales (croissance des cellules, minéralisation des os,…).

Jusqu’ici, les chercheurs n’avaient pu étudier de près que deux parties de ce récepteur : la région en interaction avec l’ADN et le domaine liant la vitamine D. Ces deux morceaux avaient été produits en laboratoire et leur structure étudiée individuellement avec la technique de cristallographie. Cette méthode n’avait pas permis de visualiser le VDR en entier car il s’est avéré difficile à cristalliser.

Pour relever ce défi – qui mobilise plusieurs équipes dans le monde depuis plus de 15 ans -, les groupes de Bruno Klaholz et de Dino Moras, tous deux directeurs de recherche CNRS à l’IGBMC, ont utilisé une technique innovante : la cryo-microscopie électronique (cryo-ME), qui nécessite un microscope électronique de dernière génération, dit “à haute résolution”. Ce bijou de technologie permet de visualiser des objets biologiques à l’échelle moléculaire, voire atomique. En France, le premier a été installé en 2008 à l’IGBMC (2). Avant ces travaux, beaucoup pensaient impossible l’étude du VDR avec la cryo-ME. En effet, jusqu’ici, les plus petites molécules visualisées avec cette technique pesaient plus de 300 kilodaltons (3) (kDa), voire quelques milliers de kDa, soit beaucoup plus que le VDR, qui pèse 100 kDa et mesure tout juste 10 nm (10 x 10-9 m).

Concrètement, Bruno Klaholz et ses collègues ont produit en laboratoire de grandes quantités du récepteur VDR humain dans des bactéries Escherichia coli (l’un des modèles les plus utilisés en biologie pour produire des protéines). Puis ils ont isolé le récepteur dans une solution physiologique contenant de l’eau et un peu de sel. L’échantillon contenant le VDR a ensuite été congelé en le plongeant dans de l’éthane liquéfié, ce qui permet un refroidissement extrêmement rapide (en une fraction de seconde, l’échantillon passe de 25°C à environ -184°C). Il a fallu, enfin, prendre 20 000 photos de particules du VDR dans différentes orientations à l’aide du microscope. Ce sont ces images qui, alignées et combinées grâce à un programme informatique, ont fourni, au final, une reconstruction en 3 D du VDR.

Cette image apporte des informations inédites sur le fonctionnement du récepteur. Elle révèle que le VDR et son partenaire RXR (récepteur du rétinoïde X, un dérivé de la vitamine A) forment une architecture ouverte, avec le domaine de liaison de la vitamine D orienté presque perpendiculairement au domaine de liaison à l’ADN (voir figure ci-dessous). Cette structure suggère une coopération entre les deux domaines, qui agiraient ensemble pour induire une régulation très fine de l’expression des gènes cibles.

Pionnier, ce travail ouvre la voie à l’étude de plusieurs autres récepteurs nucléaires vitaux encore mal étudiés. Notamment, les biologistes pensent désormais à utiliser la cryo-ME pour révéler la structure des récepteurs stéroïdiens.

Aperçu de l’architecture 3D de deux récepteurs, le VDR (récepteur de la vitamine D) et son partenaire RXR (récepteur du rétinoïde X, un dérivé de la vitamine A), après reconstruction 3D à partir des images des particules individuelles. Le filet mauve représente la carte 3D expérimentale obtenue par cryo-ME. Les sites de liaison spécifiques sur le fragment d’ADN (ou DNA en anglais) sont indiqués en vert et rouge, les domaines de liaison de l’ADN (DBD) et de liaison du ligand (LBD) sont indiqués.

Notes
(1) 12 angströms : 12 x10-¹º mètres (Un angström correspond au diamètre moyen d’un atome).
(2) Le second a été inauguré en février 2011 à l’Institut de biologie structurale (CEA / CNRS / UJF) de Grenoble.
(3) Un Dalton : c’est, avec une assez bonne précision, la masse d’un atome d’hydrogène. Un acide aminé de protéine représente environ 110 Da, un assemblage de 100 kDa contient environ 900 acides aminés.

Pourquoi certaines régions chromosomiques sont-elles sensibles à l’apparition de cassures ? Répondre à cette question est crucial, car cette fragilité est impliquée dans le développement de tumeurs. Une équipe de l’Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (CNRS/Inserm/Université de Strasbourg) vient de lever une partie du voile sur ce mystère. Laszlo Tora et ses collègues ont découvert que les cassures au niveau des gènes humains les plus longs sont dues à un phénomène jugé jusqu’ici peu probable dans les cellules des mammifères : une interférence entre deux processus génétiques clefs, la transcription (1) et la réplication de l’ADN (2). Publiés dans le journal Molecular Cell du 23 décembre 2011, ces travaux pourraient mener, à terme, à des stratégies anti-tumorales inédites.

Laszlo Tora et ses collègues ont commencé par étudier la transcription de gènes humains de très grande taille (plus de 800 kilobases -3), connus pour présenter des cassures de l’ADN appelées “sites fragiles communs”. Leur hypothèse de départ : comme le temps requis pour la transcription de ces très grands gènes est extrêmement long, ce processus de transcription pourrait être impliqué dans l’apparition des sites fragiles.

Pour la tester, les chercheurs ont utilisé la technique de cytométrie en flux. Cet outil leur a permis de trier les cellules selon leur avancement dans le cycle cellulaire (4) – cellules en phase G1 (transcription des gènes et croissance de la cellule), S (réplication de l’ADN), G2 (croissance et préparation à la division cellulaire) puis M (division cellulaire). Et, il est apparu que la transcription des très grands gènes dépasse largement la durée du cycle cellulaire, pour se terminer au début du cycle suivant, en phase G1 ou bien S. Un premier résultat étonnant : jusqu’à présent, il était admis, chez les mammifères, que la transcription des gènes avait lieu durant un même cycle cellulaire, et majoritairement en phase G1.

Comme la réplication survient pendant la phase S, les chercheurs ont soupçonné une interférence entre transcription et réplication pour expliquer les cassures sur les très grands gènes des mammifères. Ils ont donc étudié le processus de réplication sur ces gènes. Résultat : la réplication dans la région des sites fragiles survient à la fin de la phase S, alors que la transcription est encore en cours dans ces mêmes régions ! Cette découverte bouscule les connaissances actuelles en génétique. En effet, avant ces travaux, il était généralement admis que les machineries de transcription et de réplication de l’ADN ne pouvaient pas se rencontrer chez les mammifères.

Pour aller plus loin, l’équipe a cherché ensuite à savoir précisément ce qui pouvait fragiliser l’ADN quand réplication et transcription sont concomitantes. Ils ont mis en évidence des structures en boucle qui perdurent, dues à l’hybridation de l’ADN avec la molécule d’ARN produite lors de la transcription. Ce sont ces boucles ADN/ARN qui déstabiliseraient l’ADN jusqu’à provoquer des cassures en cas de stress.

Laszlo Tora et ses collègues ont commencé par étudier la transcription de gènes humains de très grande taille (plus de 800 kilobases -3), connus pour présenter des cassures de l’ADN appelées “sites fragiles communs”. Leur hypothèse de départ : comme le temps requis pour la transcription de ces très grands gènes est extrêmement long, ce processus de transcription pourrait être impliqué dans l’apparition des sites fragiles.

Pour la tester, les chercheurs ont utilisé la technique de cytométrie en flux. Cet outil leur a permis de trier les cellules selon leur avancement dans le cycle cellulaire (4) – cellules en phase G1 (transcription des gènes et croissance de la cellule), S (réplication de l’ADN), G2 (croissance et préparation à la division cellulaire) puis M (division cellulaire). Et, il est apparu que la transcription des très grands gènes dépasse largement la durée du cycle cellulaire, pour se terminer au début du cycle suivant, en phase G1 ou bien S. Un premier résultat étonnant : jusqu’à présent, il était admis, chez les mammifères, que la transcription des gènes avait lieu durant un même cycle cellulaire, et majoritairement en phase G1.

Comme la réplication survient pendant la phase S, les chercheurs ont soupçonné une interférence entre transcription et réplication pour expliquer les cassures sur les très grands gènes des mammifères. Ils ont donc étudié le processus de réplication sur ces gènes. Résultat : la réplication dans la région des sites fragiles survient à la fin de la phase S, alors que la transcription est encore en cours dans ces mêmes régions ! Cette découverte bouscule les connaissances actuelles en génétique. En effet, avant ces travaux, il était généralement admis que les machineries de transcription et de réplication de l’ADN ne pouvaient pas se rencontrer chez les mammifères.

Pour aller plus loin, l’équipe a cherché ensuite à savoir précisément ce qui pouvait fragiliser l’ADN quand réplication et transcription sont concomitantes. Ils ont mis en évidence des structures en boucle qui perdurent, dues à l’hybridation de l’ADN avec la molécule d’ARN produite lors de la transcription. Ce sont ces boucles ADN/ARN qui déstabiliseraient l’ADN jusqu’à provoquer des cassures en cas de stress.

Primordiale, cette découverte ouvre de nouvelles perspectives de recherche en médecine : les fameuses boucles apparaissent comme de possibles cibles pour réduire l’instabilité génomique et l’apparition de tumeurs.

Notes

(1) Processus lors duquel l’ADN est copié en ARN. Cet ARN est ensuite « traduit » en protéines afin de faire fonctionner la cellule.
(2) Processus permettant à l’ADN de se dédoubler avant la division de la cellule.
(3) La taille de l’ADN se mesure en Kilobase (1 kb = 1000 bases d’ADN)
(4) Ensemble des quatre phases par lesquelles une cellule passe pour se diviser, constitué de G1 (phase de transcription des gènes et de croissance de la cellule), S (réplication de l’ADN), G2 (croissance et préparation à la division de la cellule), et M (division).

Des chercheurs de l’Inra, d’AgroParisTech, CNRS, de l’Inserm, et de l’Université de Montpellier ont réussi à observer l’expression de gènes bactériens avec une précision inégalée. Par des techniques de fluorescence et de microscopie, les chercheurs ont pu compter le nombre de protéines synthétisées à la molécule près, et dans chaque bactérie individuelle d’une population. En observant une étape précoce de l’expression génique, ils sont également parvenus à associer les fluctuations de l’expression d’une cellule à l’autre avec les mécanismes moléculaires spécifiques de contrôle à l’oeuvre sur les gènes étudiés. Cette avancée pourrait permettre à l’avenir de prédire le type de mécanisme de contrôle de l’expression d’un gène sur la base du profil de fluctuation de son expression. C’est aussi une perspective intéressante pour la biologie synthétique (1) puisque cela permettra de mieux maîtriser la part aléatoire de l’expression dans les constructions synthétiques. Ces résultats sont publiés le 22 décembre 2011 dans la version en ligne des PNAS.

Le niveau d’expression de la plupart des gènes d’une cellule dépend de l’environnement dans lequel est placée cette cellule. De nombreux mécanismes de contrôle de l’expression génétique ajustent l’expression de chaque gène en fonction de l’environnement présent et permettent ainsi l’adaptation de la cellule à cet environnement. Mais, même dans un environnement stable, un gène donné n’est pas toujours exprimé au même niveau dans chaque cellule d’une population. En effet le mécanisme d’expression des gènes est un processus largement stochastique (2), largement “bruité”. C’est-à-dire que ce n’est pas un processus continu, régulier et totalement déterminé mais au contraire un processus pour partie aléatoire. A l’échelle d’une cellule unique, ceci est en partie dû au faible nombre de molécules mises en jeu : une seule copie du gène, quelques molécules régulatrices de ce gène, quelques molécules disponibles pour transcrire ce gène en ARN messager, puis quelques molécules disponibles pour enclencher la traduction de ce messager en protéine, etc. La stochasticité de l’expression des gènes peut ainsi conduire dans certains cas à une hétérogénéité de phénotypes au sein d’une population parfaitement identique génétiquement : schématiquement, une sous-population devient “verte” tandis qu’une autre devient “rouge” alors qu’elles sont génétiquement identiques et placées dans un environnement identique.

Une équipe de microbiologistes de l’Inra et d’AgroParisTech, une équipe de biophysiciens du CNRS, de l’Inserm et de l’université de Montpellier et un mathématicien du CNRS se sont associés pour développer une nouvelle méthode permettant de mesurer au fil du temps l’expression d’un gène donné, aussi faible soit-elle, dans chaque cellule bactérienne d’une population. Et cela, sans les détruire et en comptant directement, de manière absolue, le nombre de molécules produites. Ils se sont focalisés sur la première étape de l’expression, la transcription du gène en ARN messager, pour déterminer le degré et les caractéristiques du processus aléatoire relevant de cette étape précise. Ils ont étudié un petit ensemble de gènes impliqués dans les voies de dégradation et de synthèse du glucose lors d’un changement environnemental précis chez la bactérie modèle Bacillus subtilis et dont ils avaient précédemment étudié les mécanismes moléculaires de contrôle. Un modèle mathématique basé sur la connaissance préalable de ces mécanismes a permis d’analyser et d’interpréter leur impact sur le caractère aléatoire de l’expression des gènes étudiés, à l’état basal (“veille”) ou induit (“éveillé”).

Ce travail a permis la mise au point d’une méthode puissante d’exploration de la part aléatoire de l’expression génétique à l’échelle d’une cellule bactérienne (utilisable aussi pour des cellules eucaryotes). Ce type de mesure permet d’affiner la modélisation de l’expression des gènes et donc d’une part de comprendre, et d’autre part de prédire plus précisément leur comportement selon les conditions environnementales. Par ailleurs, dans une perspective de biologie synthétique, il est important de pouvoir associer à tel mécanisme de contrôle de l’expression génétique un profil de variation de cette expression entre chaque cellule d’une même population clonale, c’est-à-dire contenant exactement la même information génétique.

Un an après l’attribution du prix Nobel de chimie pour la découverte de la structure atomique du ribosome bactérien, les chercheurs de l’Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (CNRS/Université de Strasbourg/Inserm) viennent de déterminer la première structure d’un ribosome eucaryote, celui de la levure. Ces travaux publiés le 26 novembre 2010 dans la revue Science mettent fin à une course internationale effrénée pour la détermination de la structure de cette imposante machinerie cellulaire. Le ribosome eucaryote est actuellement la plus grande molécule asymétrique biologique dont la structure a été élucidée par cristallographie. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes de recherche pour la compréhension de la dynamique de la synthèse protéique et pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques.

Le ribosome, une “nanomachine” complexe

Le ribosome est une machine essentielle de la cellule qui assure la synthèse protéique à partir de l’information génétique. Il interagit avec de nombreuses protéines et occupe un rôle clé dans divers processus cellulaires. Depuis longtemps, les chercheurs tentent de déterminer sa structure atomique, défi considérable au vu de sa taille et de sa complexité. Le ribosome bactérien a une structure semblable mais non identique à celle du ribosome eucaryote (non bactérien). Il est plus petit (seulement 2.3 MDa (1) contre 3,3MDa pour le ribosome eucaryote) mais présente la même organisation générale en deux sous-unités. En 2009, le prix Nobel de chimie récompensait les chercheurs qui avaient déterminé pour la première fois la structure du ribosome bactérien. Celle de son homologue eucaryote faisait depuis l’objet d’une course effrénée.

La structure du ribosome eucaryote, une détermination difficile

Pour déterminer la structure du ribosome eucaryote, les chercheurs se sont intéressés à celui de la levure, un organisme modèle idéal, déjà connu et largement utilisé en biologie. Avec une masse d’environ 3.3 MDa, le ribosome eucaryote est plus gros de 40 pour cent par rapport à son homologue bactérien. Après de longs travaux de purification et de stabilisation de la molécule, les chercheurs strasbourgeois ont finalement obtenu sa structure atomique avec une très bonne résolution (de 0,415 nanomètres, soit une résolution à l’échelle de la molécule). L’équipe de l’Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire a confirmé l’existence de mouvements au sein des sous-unités du ribosome, mais également l’une par rapport à l’autre, mettant en évidence la dynamique de pivotement à l’origine du mécanisme de la synthèse protéique.

Des résultats prometteurs

Prochains objectifs pour l’équipe : déterminer la structure du ribosome d’autres eucaryotes mais également améliorer encore la résolution des résultats pour obtenir une description du ribosome et des mécanismes qui s’y déroulent à l’échelle atomique. La connaissance de cette structure facilitera la compréhension des relations structure/fonction à l’échelle atomique et fournira les bases moléculaires pour l’investigation des caractéristiques uniques de la machinerie traductionnelle des eucaryotes. Une telle description apportera également de précieuses informations pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les virus, les protozoaires (paludisme, maladie du sommeil, toxoplasmose, etc.), les champignons et les bactéries. En effet, en bloquant le ribosome de ces organismes, on en bloquerait toute activité.

Différentes vues de la structure du ribosome de levure : la petite sous-unité est représentée en bleu tandis que la grande apparaît en jaune. L’ARN ribosomique est représenté en rouge.